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產(chǎn)品描述

本試劑盒用于檢測細胞凋亡早期的發(fā)生，其中Annexin V為胞內(nèi)蛋白膜聯(lián)蛋白家族成員，以鈣離子依賴的方式選擇性與磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合。

PS正常分布在細胞膜內(nèi)側(cè)，即與細胞漿相鄰的一側(cè)。在細胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細胞都會把PS外翻到細胞膜外側(cè)。用帶有FITC標記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以通過流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測到PS的外翻這一細胞凋亡的重要特征。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑，在嵌入DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整的細胞膜，但可以穿透壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞。因此，將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，PI被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+）。

FITC最大吸收波長為490nm，發(fā)射波長為525nm，PI-DNA復(fù)合物的最大吸收和發(fā)射波長分別為535nm和615nm。

實驗數(shù)據(jù)

圖1. 在凋亡激活劑2(MB4124)孵育C6細胞（大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞）1.5小時后，使用我公司Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測染色效果圖。僅被綠色熒光染色的為凋亡前期細胞，被綠色和紅色雙染的是凋亡晚期或壞死細胞。

圖2. 使用我公司Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒染色后流式細胞儀檢測效果圖。A549細胞（人非小細胞肺癌細胞）用100μM凋亡激活劑2(MB4124)作用5小時后，未經(jīng)染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進行雙染(D)。從圖中可以看出，未經(jīng)染色的是雙陰性細胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預(yù)期的PI染色陽性的細胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預(yù)期的Annexin V-FITC染色陽性的細胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預(yù)期的僅Annexin V-FITC染色陽性的早期凋亡細胞和雙陽性的晚期凋亡細胞。出現(xiàn)的非預(yù)期的細胞點完全在許可的誤差范圍內(nèi)。實測數(shù)據(jù)可能會因細胞類型、細胞凋亡情況、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

操作步驟

1. 樣品染色

1)      將Binding Buffer（10×）稀釋成1×Binding buffer工作液備用（1ml Binding Buffer（10×）需加入9ml無菌去離子水）。

2)      對于懸浮細胞，500-1000g離心5min收集細胞。

對于貼壁細胞，要用不含EDTA的胰酶消化細胞，胰酶消化時間不宜過長或過短，最好是在輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，加入細胞培養(yǎng)液，將細胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，500-1000g離心5min收集細胞。

3)      收集細胞后，加入預(yù)冷PBS溶液輕搖或用移液器輕柔吹打洗滌，離心收集細胞，共洗滌兩次。

4)      在細胞沉淀中加入1×Binding buffer工作液，重懸細胞，使細胞濃度達到1×10⁶ cell/ml。

5)      吸取100μl細胞懸液（細胞總數(shù)為1×10⁵ cell）至一新管中，加入5μl Annexin V-FITC和5-10 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。

2. 樣品檢測

1)      流式細胞儀檢測：

建議設(shè)置正常細胞、PI單染和Annexin V-FITC單染3個對照組，正常細胞組可作為熒光補償調(diào)節(jié)去除光譜重疊和設(shè)定十字門的位置。若十字門的位置不易設(shè)定，可采用經(jīng)凋亡誘導(dǎo)的細胞進行設(shè)定。結(jié)果可用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)ITC為橫坐標，PI為縱坐標。Annexin V-FITC和PI聯(lián)合使用時，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色雙重熒光。

2)      熒光顯微鏡檢測：

染色孵育后涂片，顯微鏡下觀察。使用熒光顯微鏡上的藍光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細胞膜完整性的細胞，細胞核顯示紅色，膜上有綠色光環(huán)。

保存條件

2-8℃避光保存，一年有效。Annexin V-FITC不可冷凍。

注意事項

1.   可立式離心管內(nèi)試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2.   Annexin V-FITC和碘化丙啶（PI）是光敏物質(zhì)，在保存與操作時請注意避光。

3.   在細胞洗滌的最后一步，請盡量將上清棄凈，以免PBS殘留影響實驗結(jié)果。

4.   為獲得準確試驗結(jié)果，建議樣品在Annexin V-FITC染色后1小時內(nèi)進行分析。

5.   為了您的安全和健康，請穿戴實驗防護服、手套、口罩等必要的防護裝備。