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為您推薦PWL209，產(chǎn)品升級，性能更優(yōu)。

產(chǎn)品內(nèi)容：

產(chǎn)品簡介：
“雙報告基因”檢測系統(tǒng)通常被用來提高實(shí)驗(yàn)精確度，即在一個系統(tǒng)中同時表達(dá)和測量兩個獨(dú)立的報告基因。一般來說，實(shí)驗(yàn)組報告基因與具體實(shí)驗(yàn)條件的影響是相關(guān)的，而共同轉(zhuǎn)染的內(nèi)對照組報告基因則是用來充當(dāng)校正參數(shù)，作為內(nèi)參提供反應(yīng)基線。將實(shí)驗(yàn)組的結(jié)果與內(nèi)對照組的結(jié)果進(jìn)行約化處理，可降低由細(xì)胞存活率或轉(zhuǎn)染效率的差異而導(dǎo)致的結(jié)果波動，同時還可消除儀器測定引起的實(shí)驗(yàn)誤差。因此，雙報告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

美侖NANO&FIREFLYGLO雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)是一種輝光型定量檢測試劑盒，具有高靈敏度和發(fā)光信號穩(wěn)定的特點(diǎn)，符合高通量檢測的需求。該檢測試劑盒在同一個樣品中先以一種新型螢光素為底物來檢測螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase），后以新型底物來檢測NANOLIGHT螢光素酶，同時淬滅Firefly luciferase的螢光信號，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。
相比于美侖輝光型FIREFLY&RENILLALIGHT雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（MA0520），本品NANO&FIREFLYGLO Luciferase Reporter Assay Kit（MA0522）具有以下優(yōu)點(diǎn)：采用了全新的螢光素酶檢測新型底物和NANOLIGHT螢光素酶，具有更高的發(fā)光強(qiáng)度，該輝光型試劑盒近乎達(dá)到了閃光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（MA0518）的靈敏度；具有更好的發(fā)光信號的穩(wěn)定性，近乎2小時的信號半衰期為實(shí)驗(yàn)設(shè)計提供了更大的靈活性；高通量檢測無需依賴自動進(jìn)樣器，并且無需棄培養(yǎng)液、離心等步驟，簡化了實(shí)驗(yàn)流程；本試劑盒組分做了大量優(yōu)化，與傳統(tǒng)閃光型產(chǎn)品相比，無明顯刺激性氣味。NANO&FIREFLYGLO雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒可用于多種常用細(xì)胞培養(yǎng)液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均為2小時左右（22℃），滿足絕大多數(shù)高通量實(shí)驗(yàn)需求。
反應(yīng)原理如下：

 

1.自備材料
PBS；多道排槍；白色不透光細(xì)胞培養(yǎng)板；化學(xué)發(fā)光儀或酶標(biāo)儀。

2.檢測前準(zhǔn)備
1）首次使用時將Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Reaction Buffer一次性全部倒入Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Substrate瓶中，充分混勻直至所有底物溶解。按使用需求進(jìn)行分裝，建議-70℃長期保存或者短期存放于 -20℃不超過一個月，并盡快使用。
2）Stop & NANOLIGHT Substrate (100x)，每次開蓋前需進(jìn)行短暫低速離心。
3）根據(jù)實(shí)際使用量，以100:1的比例將適量的Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer與Stop & NANOLIGHT Substrate (100x)混勻，室溫避光備用。例如：如果需要100ml反應(yīng)液，則需要加入1ml的檢測底物。
注：建議現(xiàn)配現(xiàn)用，剩余的含有底物的反應(yīng)液在當(dāng)次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，直接舍棄，不要留存。

3.操作方法

1）從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)板，放置5-15min，恢復(fù)至室溫。
注：使用白色不透光的細(xì)胞培養(yǎng)板，減少孔間的信號干擾。

2）Firefly Luciferase反應(yīng)檢測
a．使用多道排槍向每個細(xì)胞孔中加入平衡至室溫的含有底物的Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Reaction Buffer，加樣體積與細(xì)胞培養(yǎng)液體積相同并混勻。由于需要分別加入兩種檢測溶液，為防止孔板液體溢出，96孔板建議加入80ul培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80ul檢測溶液。
b．室溫下孵育5-10min。為了使細(xì)胞裂解充分，也可將細(xì)胞培養(yǎng)板放在振蕩混勻儀或附帶振板功能的儀器上，室溫條件下，采用中高速振板5-10min。
注：孵育時間，可根據(jù)細(xì)胞量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，確保細(xì)胞充分裂解，得到穩(wěn)定的發(fā)光檢測結(jié)果。
c．孵育后于化學(xué)發(fā)光儀或酶標(biāo)儀中檢測Firefly Luciferase報告基因活性。
注：發(fā)光信號會逐漸衰減，為得到最佳檢測結(jié)果，請在加入檢測試劑后2小時內(nèi)完成檢測。

3）NANOLIGHT Luciferase反應(yīng)檢測
a．使用多道排槍向每個細(xì)胞孔中加入平衡至室溫的含有底物的Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer，加樣體積與初始細(xì)胞培養(yǎng)液體積相同并充分混勻。例如，96孔板建議加入80ul培養(yǎng)液，相應(yīng)加入80ul檢測溶液。
b．將細(xì)胞培養(yǎng)板放在振蕩混勻儀或附帶振板功能的儀器上，室溫條件下，采用中高速振板至少3min。使溶液充分混勻，得到最佳淬滅效果。
c．孵育至少10min后（包括前面振板3min）于化學(xué)發(fā)光儀或酶標(biāo)儀中檢測NANOLIGHT Luciferase報告基因活性。
注：發(fā)光信號會逐漸衰減，為得到最佳檢測結(jié)果，請在加入檢測試劑后2小時內(nèi)完成檢測。

注意事項(xiàng)：

1．檢測儀器選擇：能夠檢測化學(xué)發(fā)光的儀器都適用本試劑盒的檢測，但是針對相同的樣品，不同檢測器本底信號值和測量值均可能不同；且對于同一樣本檢測，不同儀器的數(shù)值不可橫向比較。為防止孔間干擾，推薦使用不透明白色細(xì)胞培養(yǎng)板。
2．由于發(fā)光信號會受到檢測環(huán)境如培養(yǎng)基組分、溫度等影響，所以應(yīng)確保同組內(nèi)不同樣本檢測條件一致。
3．酶促反應(yīng)對溫度較為敏感，加樣檢測前務(wù)必將檢測試劑以及細(xì)胞培養(yǎng)板平衡至室溫。
4．NANOLIGHT螢光素酶具有超強(qiáng)信號穩(wěn)定性，半衰期可達(dá)2小時。但是當(dāng)酶表達(dá)量過高時，信號半衰期會縮短，建議優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計方案（如減少質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量），避免螢光素酶表達(dá)量過高。
5．為取得最佳檢測結(jié)果，加入Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer后，需要孵育至少10min才可以檢測NANOLIGHT Luciferase報告基因活性，其中包括振動混勻至少3min。

保存條件：

全新試劑盒-20℃保存，一年有效。
溶解分裝后的Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年，或-20℃短期保存不超過一個月。
短期運(yùn)輸條件：

避光冷藏。

數(shù)據(jù)展示

 
圖1. NANO&FIREFLYGLO發(fā)光淬滅效果對比P進(jìn)口品牌。相同濃度的NANOLIGHT、Firefly螢光素酶的體系中，依次加入FIREFLYGLO和Stop&NANOLIGHT反應(yīng)液，分別記錄兩者螢光素酶的發(fā)光強(qiáng)度以及淬滅情況。由圖可知，美侖組的雙酶發(fā)光強(qiáng)度與P進(jìn)口品牌基本無差別，并且淬滅效率要高于P進(jìn)口品牌。

 
圖2. NANOLIGHT/FIREFLYGLO發(fā)光穩(wěn)定性對比P進(jìn)口品牌。螢光素酶在一定濃度范圍內(nèi)，Meilunbio的NANOLIGHT/FIREFLYGLO的絕對光強(qiáng)與P進(jìn)口公司非常接近；而且Meilunbio的NANOLIGHT發(fā)光穩(wěn)定性在體外NANOLIGHT酶檢測中要好于P進(jìn)口品牌。
 
圖3. NANOLIGHT/FIREFLYGLO線性范圍驗(yàn)證。單一時刻下，美侖NANOLIGHT、FIREFLYGLO螢光素酶濃度-光強(qiáng)標(biāo)曲線性良好（R2(NANOLIGHT)=0.999；R2(Firefly)=0.999）

 
圖4. NANOLIGHT/FIREFLYGLO在不同培養(yǎng)基發(fā)光檢測。圖中數(shù)據(jù)分別以各自的RPMI-1640組做歸一處理，美侖NANOLIGHT/FIREFLYGLO發(fā)光體系在常用培養(yǎng)基：MEMα、F12、DMEM/F12、DMEM、RPMI-1640中都可以正常發(fā)光。
 
圖5. NANOLIGHT/FIREFLYGLO酚紅耐受能力檢測。配制含有酚紅濃度梯度的PBS溶液0-20mg/L，每組分別加入等量的NANOLIGHT螢光素酶或螢火蟲螢光素酶，再檢測NANOLIGHT、FIREFLYGLO 的發(fā)光效果。由圖可知，Meilunbio? NANOLIGHT/FIREFLYGLO對比P進(jìn)口公司具有更強(qiáng)的酚紅耐受能力。

 
圖6. 細(xì)胞培養(yǎng)體系中NANOLIGHT /FIREFLYGLO光強(qiáng)穩(wěn)定性(A)和細(xì)胞密度-光強(qiáng)標(biāo)曲(B)示例。在細(xì)胞培養(yǎng)基環(huán)境中，原位追蹤檢測NANOLIGHT和FIREFLYGLO發(fā)光。由圖可知，NANOLIGHT和FIREFLYGLO螢光穩(wěn)定性和絕對光強(qiáng)與P進(jìn)口品牌基本一致；而且，美侖組單一時刻條件下的細(xì)胞密度-光強(qiáng)標(biāo)曲線性良好（R2=0.999（NANOLIGHT）；R2=0.996（Firefly））。

 
圖7. TNFα 梯度誘導(dǎo)NF-κB信號通路檢測效果對比P進(jìn)口品牌。HEK-293T細(xì)胞共轉(zhuǎn)染了NANOLIGHT_PEST螢光素酶NF-κB response reporter 和Firefly螢光素酶內(nèi)參質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后12h，進(jìn)行TNFα濃度梯度（0-20ng/ml）誘導(dǎo)5h后，在細(xì)胞培養(yǎng)體系內(nèi)，按照說明書步驟依次孵育并使用酶標(biāo)儀分別檢測雙酶的信號讀值，并對NANOLIGHT和FIREFLYGLO光強(qiáng)進(jìn)行約化處理（NANOLIGHT/Firefly）。由圖可以明顯看出NANOLIGHT /Firefly比值與給藥濃度呈正相關(guān)，并且美侖組的檢測效果與P進(jìn)口品牌無明顯差異。（儀器：BioTek HTX）

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